1材料与方法
1.1材料
1.1.1培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：去皮马铃薯20g，葡萄糖2.0g，琼脂1.5-2.0g，水100mL，pH自然；牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（NA）：牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0g，NaCl0.5g，琼脂1.5-2g，水100mL，pH7.0；牛肉膏蛋白胨培养基（NB）：牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0g，NaCl0.5g，水100mL，pH7.0。
1.1.2供试菌株
芽孢杆菌：敦煌地区盐碱土壤中分离筛选得到21株芽孢杆菌，由本实验室保存。指示病原菌：分离自甘肃陇西黄芪1号栽培基地的黄芪根腐病病原菌G2茄腐镰刀菌（F.solaniun），由本实验室保存。
1.2方法
1.2.1生防芽孢杆菌的初筛
将保存的21株芽孢杆菌接于NA平板，在37℃恒温培养箱中活化24h后备用，黄芪根腐病病原菌G2在PDA平板，在28℃恒温培养箱中活化6d后备用。采用平板对峙法［2］测定21株芽孢杆菌对黄芪根腐病原菌G2抑菌率，各处理3次重复，在28℃恒温培养5d。计算公式：抑菌率=（对照组直径-试验组直径）/对照菌落直径×100%［2］。
1.2.2生防芽孢杆菌的复筛
选择初筛中抑菌率大于70%的菌株进行复筛，将活化后待筛选的拮抗芽孢杆菌分别接入等量的NB液体培养基中，在37℃，160r/min的条件下振荡培养48h后，将培养好的菌液在4℃，10000r/min离心10min，弃去沉淀，上清液用0.22μm的微孔滤器过滤，得到无菌上清液，备用［3］。
采用琼脂扩散法，将PDA培养基在灭菌后冷却至50℃左右，以200∶1的比例加入病原真菌菌悬液，混合均匀后倒入已用水琼脂作为底层的培养皿中，制备带菌平板，待平板凝固后，用已灭菌的打孔器在平板上打孔，向孔内加入200μL发酵上清液，以加入等量无菌水作为对照组，各处理3次重复。在28℃恒温培养3d后，利用上述计算公式测定抑菌率，筛选出对黄芪根腐病病原菌G2拮抗作用最强的菌株。
1.2.3菌体形态观察
将优势生防芽孢杆菌接种于NA培养基平板，37℃恒温培养24h，再对菌株进行革兰氏染色、镜检，观察优势生防芽孢杆菌的菌落、菌体形态特征。
1.2.4生理生化特征测定
根据《伯杰氏细菌鉴定手册》［4］与《常见细菌系统鉴定手册》［5］对筛选出来的优势生防芽孢杆菌株进行明胶液化、淀粉水解等生理生化鉴定。
1.2.516SrDNA基因序列分析
采用土壤DNA小量提取试剂盒提取细菌DNA，采用16SrDNA细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增。PCR反应体系（30μL）：模板DNA4μL，引物各1μL，Taq酶15μL，ddH2O9μL；反应参数：95℃5min；95℃1min，57℃1min，72℃2min，共25个循环；72℃总延伸10min。PCR扩增后，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将扩增产物送至甘肃中鼎森生物科技有限公司测序，经过NCBI数据库进行BLAST比对分析，利用MEGA7.0软件，设置Bootstrapvalues为1000，使用邻近法方法构建系统发育树［2］。
1.2.6拮抗芽孢杆菌的盆栽防效试验
通过黄芪苗盆栽试验测定拮抗芽孢杆菌对该病原菌的防治作用。
（1）病原菌孢子悬液的制备：分别刮取PDA平板上28℃，培养10d的病原菌，将其分散到6g/LCMC（羧甲基纤维素钠）溶液中制成孢子悬液，孢子浓度调至2.0×107CFU/mL［6］。
（2）盆栽试验设计：从甘肃陇西黄芪1号栽培基地选取长势一致的健康蒙古黄芪苗分成3组，即空白组（不接菌种）、对照组（接种病原菌）、试验组（接种病原菌和拮抗芽孢杆菌），每处理12盆，每盆3株，幼苗移栽至装有混合营养土（营养土∶蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1）的塑料小花盆中，14d后采取伤根灌注法［7］向对照组和试验组接种上述病原菌孢子悬液，每盆接种量均为5mL，以接等量无菌水为对照。接种病原菌14d后，分别向每盆试验组接种5mL拮抗芽孢杆菌发酵滤液，以接等量无菌水为空白对照。
（3）防效测定：培养28d后观察统计发病情况，按照植物病害分级标准计算防治效果。
黄芪根腐病分级标准为0级，无病斑；1级，有病斑1%-5%；2级，有病斑6%-10%；3级，有病斑11%-20%；4级，有病斑21%-40%；5级，有病斑41%-60%；6级，病斑61%-80%；7级，81%以上。计算公式：发病率=发病植株数/调查总株数×100%；病情指数=∑（病级总株数×发病级别）/（调查总株数×最高级别）×100%；防治效果=（对照病情指数-试验病情指数）/对照病情指数×100%［8］。
（1）病原菌孢子悬液的制备：分别刮取PDA平板上28℃，培养10d的病原菌，将其分散到6g/LCMC（羧甲基纤维素钠）溶液中制成孢子悬液，孢子浓度调至2.0×107CFU/mL［6］。
（2）盆栽试验设计：从甘肃陇西黄芪1号栽培基地选取长势一致的健康蒙古黄芪苗分成3组，即空白组（不接菌种）、对照组（接种病原菌）、试验组（接种病原菌和拮抗芽孢杆菌），每处理12盆，每盆3株，幼苗移栽至装有混合营养土（营养土∶蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1）的塑料小花盆中，14d后采取伤根灌注法［7］向对照组和试验组接种上述病原菌孢子悬液，每盆接种量均为5mL，以接等量无菌水为对照。接种病原菌14d后，分别向每盆试验组接种5mL拮抗芽孢杆菌发酵滤液，以接等量无菌水为空白对照。
（3）防效测定：培养28d后观察统计发病情况，按照植物病害分级标准计算防治效果。
黄芪根腐病分级标准为0级，无病斑；1级，有病斑1%-5%；2级，有病斑6%-10%；3级，有病斑11%-20%；4级，有病斑21%-40%；5级，有病斑41%-60%；6级，病斑61%-80%；7级，81%以上。计算公式：发病率=发病植株数/调查总株数×100%；病情指数=∑（病级总株数×发病级别）/（调查总株数×最高级别）×100%；防治效果=（对照病情指数-试验病情指数）/对照病情指数×100%［8］。
1.2.7数据处理
数据采用SPSS17.0软件进行方差分析，处理间差异的多重比较采用Duncan氏新复极差法。
