大蒜抗根结线虫内生细菌的筛选及盆栽防效试验
摘要：利用稀释涂布平板法，从受根结线虫为害的大蒜根须组织研磨液中筛选对根结线虫有明显抑杀效果的内生生防细菌。结果表明，在盆栽试验中，菌株 S1- 1 对根结线法的杀线虫由活性为 90.8%。通过盆栽试验验证生防菌株的防效，菌株 S1- 1 防效为 74.86%。结合菌株形态特征、分子生物学和生理生化特性，将菌株 S1- 1 鉴定为短小芽孢杆菌 （Bacillus pumilus）。
根结线虫病是如今设施农业中重要的土传病害之一，每年在全球范围内造成的损失高达 1 000 亿美元[1- 3]。根结线虫寄主范围十分广泛，大部分农作物都可以成功侵染，严重时作物减产高达 75%以上。利用稀释涂布平板法从受根结线虫为害的大蒜根须组织研磨液中进行根结线虫生防细菌的筛选，并得到一株对根结线虫具有较好防治效果的芽孢杆菌菌株，为根结线虫的生物防治提供了资源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物样品
山东青岛采集的受根结线虫为害的大蒜样品。
1.1.2 供试线虫
南方根结线虫，青岛农业大学植物医学学院线虫实验室提供。
1.1.3 LB 固体培养基 （LBA） 培养基配方
胰蛋白胨 5 g，酵母抽提物 2.5 g，Na Cl 5 g，琼脂粉 7.5 g，蒸馏水定容至 500 m L，p H 值 7.0。
1.2 试验方法
1.2.1 生防细菌的分离
称取受根结线虫为害的大蒜根须 10 g，用 1%的次氯酸钠消毒 5 min，再用无菌水漂洗 3 遍，放入灭菌研钵中研磨成糊状，然后用少量无菌水洗入装有90 m L 无菌水的三角瓶中；充分混匀后静置 10 min；吸取 100 μL 稀释液均匀涂布在 LBA 培养基于 37 ℃恒温培养 2~3 d；挑取形态不一样的单菌落用平板划线法分离纯化，将得到的菌株转接到 LBA 培养基斜面培养 24 h，于 4 ℃下进行保存。
1.2.2 南方根结线虫悬浮液制备
从南方根结线虫的空心菜上挑取成熟的线虫卵块，用 0.5%的次氯酸钠消毒 1 min，无菌水冲洗干净。将卵块收集到灭菌培养皿中，加入少量无菌水，于 28 ℃下恒温孵化，48 h 后收集孵化的线虫，备用。
1.2.3 生防细菌的筛选
挑取 4 ℃保存于 LBA 培养基斜面的菌株，于LBA 平板上划线、活化，1 d 后挑取单菌落转接到装有 100 m L 的 LB 液体培养基的三角瓶中，于 37 ℃，200 r/min培养 48 h。发酵结束后，取发酵液以转速9 000 r/min 离心 10 min，取上清液备用。取 24 孔板向其中加入 1 m L 上清液，对照组加等量无菌水，挑入大约 50 条线虫，于 28 ℃下恒温培养，记录 24 h后线虫死亡数，计算线虫的校正死亡率。筛选出对南方根结线虫触杀效果强的生防菌株。
1.2.4 生防菌形态
观察将对根结线虫直接触杀效果良好的细菌在 LBA培养基平板上划线，于 37 ℃下恒温培养 24 h，观察细菌的单菌落形态，再对菌株进行革兰氏染色、镜检。
1.2.5 生理生化鉴定
根据 《伯杰氏细菌鉴定手册》 8 与 《常见细菌系统鉴定手册》 9 对筛选出来的根结线虫触杀效果良好的生防细菌进行伏 - 普试验、柠檬酸盐利用试验等生理生化鉴定。
1.2.6 细菌 DN A 的提取及 16 Sr DN A 基因序列分析
利用 Omega Bio- Tek 试剂盒提取生防芽孢杆菌的DNA； 采 用 16 Sr DNA 细 菌 通 用 引物 27F/1492R 进行 PCR 扩增；PCR 反应体系 （25 μL）：10X Buffer2.5 μL，d NTP 2 μL，引物 27F/1492R 各 1 μL，r Taq0.5 μL，dd H2O 16 μL，模板 DNA 2 μL；反应参数：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s。63 ℃退火 30 s；72 ℃延伸 90 s；共 35 个循环；72 ℃总延伸 7 min；4 ℃保存。PCR 扩增后，采用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，将扩增产物送至北京擎科新业生物技术有限公司测序，经过 NCBI 数据库进行 BLAST 比对分析，构建系统进化树。
1.2.7 根结线虫生防细菌盆栽防效试验
待供试番茄 （丽春） 长出第 4 片真叶后，进行细菌发酵液的制备，菌体浓度最终调成 1×107/m L。在处理组番茄根部浇 20 m L 生防菌发酵液，对照番茄根部仅浇灌无菌水。3 d 后，在番茄根部均匀接种南方根结线虫二龄幼虫 （1 000 条 / 株），每个处理20 棵番茄，接种 37 d 后调查番茄发病情况，参考Bridge 和 Page 的方法对根结分级[4]，统计番茄的根结数和病情指数计算出防效。
