优选盆栽小菊高效再生及转化体系的建立
摘要:为筛选最适盆栽小菊品种，建立再生转化体系，以11个盆栽小菊品种无菌苗叶片为外植体，比较不同植物生长调节剂配比和抗生素对叶片愈伤组织诱导、不定芽分化及生根等过程的影响。结果表明，11个品种中再生率最高的为微风深红，其最适分化培养基为MS+1．0mg/L6－BA+0．2mg/LNAA，再生率为95．0%;叶片分化对卡那霉素和潮霉素的抗性选择压分别为15、10mg/L;对植株生根的抗性选择压分别为10、8mg/L;羧苄青霉素抑菌浓度最适范围为200～400mg/L。本研究建立了盆栽小菊叶片外植体的高效再生及转化体系，为今后菊花的转基因工作奠定良好的基础。
菊花(ChrysanthemummorifoliumＲamat．)在我国有着源远流长的栽培历史，至今已培育出各具特色的品种群，发展成为世界四大切花之一，具有很高的观赏和经济价值［1］，因而筛选、培育具有优良性状的新品种十分具有实用意义。随着植物基因工程技术的发展，通过基因工程改良性状己经逐渐成为植物定向遗传改良的重要手段。由于菊花的品种繁多、遗传背景复杂，不同基因型菊花的再生能力也各不相同［2］。研究表明，基因型差异是影响菊花再生的主要因素［3］。
Horsch等在之前的农杆菌介导法转化试验中利用叶盘转换法，对多个不同品种的菊花进行再生试验，结果发现，不同品种的菊花有着较大差异的遗传转化率，表明菊花的转化效率依赖于品种［4］。目前，已经利用叶片、叶柄、茎段、花器官等外植体实现了不同品种菊花再生和转化体系的建立［5－6］，而应用于遗传转化最普遍的受体材料是叶片［7］。
利用盆栽小菊进行再生及转化体系建立至今未见报道。本研究以11个盆栽小菊新品种叶片为外植体，从基因型、6－苄氨基嘌呤(6－BA)和萘乙酸(NAA)激素配比以及抗生素对菊花再生的影响进行系统深入的研究，旨在建立高效再生及转化体系，为盆栽小菊的分子遗传育种奠定基础。
1材料与方法
1．1试验材料
供试材料为盆栽小菊品种微风深红、花洒绿色心情、色彩火山、微风橙绿、微风玫瑰、微风索尔、青柠水晶、梦幻粉水晶、红水晶、微风红霞和粉色，取自南京农业大学中国菊花种质资源保存中心。
1．2性状选取与数量采集
从定植到开花期，对11个品种的株高、茎粗、花径、花型、花色、定植时间、现蕾时间、开花时间这9个性状［8］采用直尺、游标卡尺、目测的方法进行测定，每个品种10次重复。
1．3培养基与培养条件
以MS培养基［9］作为基本培养基，在此基础上添加30g/L蔗糖和6．5g/L琼脂，植物生长调节剂选用不同浓度比的6－BA和NAA，用1mol/LNaOH调节pH值至5．8，
116℃高温高压灭菌30min。培养室温度为25℃，光照度20～25lx，每天光照12h。
1．4不同基因型叶片外植体再生差异
挑选3个具有代表性的、含不同浓度比6－BA和NAA的分化培养基M2、M5、M7(表1)对11个品种进行初步筛选［10］。从中挑选出再生率高的6个品种，使用9个不同浓度配比6－BA和NAA的分化培养基M1～M9(表1)对其细筛选。各品种每个培养基接种30个叶盘，3次重复。30d后统计再生率，不定芽再生率=再生不定芽外植体数/接种外植体总数×100%。
1．5卡那霉素和潮霉素筛选浓度的确定
1．5．1叶片外植体分化
以筛选出的品种为材料，将叶片接种于含不同浓度梯度的卡那霉素(Km)和潮霉素(Hyg)的最适分化培养基上，Km和Hyg设置0、5、10、15、20、25mg/L6个浓度处理，每个处理接种30个外植体，3次重复。30d后统计分化情况。
1．5．2不定芽生根
以筛选出的品种为材料，将不定芽接种于含不同浓度梯度的Km和Hyg的生根培养基上，Km和Hyg设置为0、5、8、10、12、15mg/L6个浓度处理，每个处理接种10个外植体，3次重复。15d后统计生根情况。
1．6羧苄青霉素抑菌浓度的确定
将生长状况一致的叶片外植体用无菌手术刀切成约5cm×5cm大小的叶盘，在最适分化培养基上培养3d，用农杆菌侵染7min后将多余菌液吹干，置于最适分化培养基中黑暗共培养3d，将叶盘转入含有不同浓度的羧苄青霉素(Cb)培养基中，Cb设置为0、200、300、400、500mg/L共5个处理，同时以未侵染农杆菌的叶盘作为空白对照，每个处理接种20个外植体，每个处理3次重复。15d后统计抑菌情况。
