施用硒肥对草莓根际土壤真菌群落结构的影响
周亚茜，薛征，宋晋汇，蒋媛媛，冯晓卿，武嘉伟，张抗萍*（太原学院，山西太原030032）
摘要：为明确硒肥处理下草莓根际土壤真菌群落的影响，设置不施加硒肥（Se0）处理和多肽生物有机硒肥（Se）处理开展地栽试验，利用ITS高通量测序，探究草莓根系土壤真菌群落结构及功能特征。结果表明，在草莓根际土壤真菌中子囊菌门（Ascomycota）为门水平上的优势类群；在属水平上，赤霉属（Gibberella）是主导类群，在Se0和Se处理下，其相对丰度分别为34.7%和26.5%。不同硒肥处理下草莓根际土壤真菌群落α多样性差异不显著。与未施硒肥相比，施硒肥处理还能够增加担子菌门和罗兹菌门等物种的丰度，而降低植物病原体的菌群组成，为草莓生长提供更适宜的土壤生境。
我国72%的地区被评估为缺硒区，其中30%严重缺硒[1]，主要包括从东北至西南地区而形成的低硒带[2]。土壤低硒导致作物产品缺硒，可能进一步使人体缺硒而患大骨节病[3]。研究表明，作为人类所必需微量元素之一[4]，保证每日适当的硒摄入量不仅能提高自身的免疫力，维持人体的健康，而且能调节人体的能量代谢功能，延缓衰老[5]。更重要的是，人体吸收足量的硒元素还能为某些癌症的发生起到抑制作用[6]。但硒并不能靠人体自身形成，只能从外界获取[7]。人能够吸收的食物中的硒主要来自于土壤中的有机硒成分[8]。因此，为弥补我国土壤硒含量的缺失，人工富硒农产品势在必行[9]。
目前，在硒肥处理下，研究土壤微生物群落特征的试验已在水稻[10]、谷子[11]、小麦[12]等粮食作物中进行，在草莓这类果类作物中的研究大多集中在富硒对草莓果实品质及叶片光合作用等方面的影响[13-15]，而对草莓植株根际微生物群落多样性及结构的响应研究较少。因此，本研究以草莓根际土壤真菌群落为研究对象，采用ITS基因高通量测序技术，探究施硒肥土壤真菌群落结构特征，以期能为硒肥的可持续利用提供理论基础。
1材料与方法
1.1试验材料
试验在山西省太原市小店区太原学院汾东校区智能温室（112°64′E、37°73′N）开展，土壤主要理化性质为：pH值8.55、有机质16.06g/kg、全氮1.14g/kg、全磷0.72g/kg、全钾15.95g/kg。供试草莓品种为章姬。于2023年10月移栽。试验选取同批次，且生长状态良好、长势一致的植株。硒肥采用欣速达多肽生物有机硒氨基酸水溶肥料（有机硒≥2500μg/L）购自山西欣普旺农业科技有限公司。
1.2试验方法
采用根灌施肥（Se）的方式，设置氨基酸水溶肥500倍液以及根灌清水对照（Se0）。起垄地栽，覆黑色地被膜，膜厚0.06mm，间隔12~15cm种植。试验小区面积12m2（2m×6m），定植120株。从草莓始花期开始根灌施肥，每隔15d1次，共4次。2024年2月中旬在各小区内随机挖取5株带土草莓，轻轻抖掉草莓根上附着土壤后，使用灭菌后的镊子刮取根系表面土壤混合作为一个土壤样品。过2mm筛后密封并放入-80℃冰箱暂存。取0.5g土壤样品，使用FaStDNATMSPIN试剂盒（MPBiomedicals，Irvine，CA）提取DNA，利用引物ITS1F/ITS2R进行PCR扩增。送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。
1.3数据处理
利用IlluminaMiSeq高通量测序平台，对样本中真菌微生物进行分类。按100%相似性进行ASVs聚类，并分析真菌物种注释和丰度。通过进一步比对分析，计算其ASVs数量和比例，绘制真菌α多样性指数、NMDS图、Venn图、门及属水平相对丰度图和功能预测图。
2结果与分析
2.1不同处理中草莓根际真菌稀释曲线分析
基于α多样性中的Sobs和Shannon指数绘制不同处理下土壤真菌的稀释曲线（图1），结果显示，随着测序数量的增加，曲线的斜率逐渐减缓，最终趋于平稳。表明不同施肥处理下真菌数量分布相对均匀，测序结果能够覆盖土壤样品中绝大多数的微生物物种信息，为后续分析提供了可靠的依据。
2.2不同处理中草莓根际土壤真菌群落组成
通过绘制Veen图，比较未施硒肥和施硒肥处理下土壤真菌ASVs的物种差异和相似性（图2）。本研究中共获得1886个不同的物种，不同处理共有物种数为473个。Se处理下真菌物种数为1146个，特有物种数673个；Se0处理下真菌物种数为1213个，特有物种数740个。
通过对获得的1886个ASVs所对应的序列进行分类学统计，发现草莓植株根际土壤真菌群落主要分布在11门35纲84目181科374属。不同处理下土壤样品与门水平丰度Top10的物种组成关系如图3所示，子囊菌门（Ascomycota）、未分类菌门（unclassi-fied_k_Fungi）、被孢霉门（Mortierellomycota）、罗兹菌门（Rozellomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为门水平上的优势类群，子囊菌门（Ascomycota）在Se0和Se处理中的相对丰度分别为87.0%和84.0%，未分类菌门（unclassified_k_Fungi）在各样品中的相对丰度分别为6.0%和5.0%，被孢霉门（Mortierellomycota）在各样品中的相对丰度都为4.0%。罗兹菌门（Rozellomycota）在Se0和Se处理中的相对丰度分别为1.0%和4.0%；担子菌门（Basidiomycota）在Se0和Se处理中的相对丰度分别为1.0%和3.0%。
由图4可知，门水平上，Se0和Se处理下子囊菌门（Ascomycota）、未分类菌门（unclassified_k_Fungi）、被孢霉门（Mortierellomycota）、罗兹菌门（Rozellomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为优势群落，占比95.0%以上，子囊菌门是2个处理中含量最高的真菌门，分别在Se0和Se中占处理总序列的87.0%和84.0%。而硒肥处理下罗兹菌门和担子菌门的相对丰度有所提高。
分析不同处理下真菌属水平群落相对丰度组成（图5），可知赤霉属（Gibberella）是主导类群，在Se0和Se处理下其相对丰度分别为34.7%和26.5%，未命名菌属（Unclassified_k_Fungi）相对丰度分别为5.84%和4.75%，癣囊腔菌属（Plectosphaerella）相对丰度分别为3.94%和5.38%，头束霉属（Cephalotrichum）相对丰度分别为0.81%和5.87%。
2.3施硒肥处理草莓根际真菌分布特征
通过对微生物群落进行LEfSe分析，可知不同处理下土壤微生物在2门、2纲、3目、6科、10属上共有23个不同分类水平上的真菌群落存在显著差异（图6）。Se0处理下有9个生物标记物，主要集中在科和属水平上，如在科水平上，丛赤壳科（Nectriaceae）、格孢腔菌科（Pleosporaceae）和葫芦科（Cucurbitariaceae）等。在属水平上，赤霉属（Gibberella）、毛壳菌属（Chaetomi-um）、曲霉属（Aspergillus）和枝顶孢属（Acremonium），另外还有目水平的肉座菌目（Hypocreales）。而Se中共有14个生物标记物，主要集中在属水平上，如：头束霉属（Cephalotrichum）、梭孢壳属（Thielavia）、嗜热菌属（Mycothermus）等，另外在门、纲、目和科水平上分别有2个、1个、2个和1个。可见，Se处理下中存在的显著差异物种多于对照组（P＞0.05）。
2.4不同处理中草莓根际土壤真菌功能预测分析
为了解详细的物种生态功能，对各样品菌群进行生态功能预测分类，采用FUNGuild预测功能，并对样品中相对丰度超过1.0%的菌群进行作图。由图7可知，土壤真菌已鉴定出的主要生态功能菌群是植物病原体（PlantPathogen），在Se和Se0处理中的占比分别为38.15%和46.23%，其次是未定义腐生菌（UndefinedSaprotroph），分别占比为20.50%和16.34%。除此之外，还有未知的功能（unknown）、动物病原体-粪便腐生菌-内生菌-附生菌-植物腐生菌-木材腐生菌（Ani-malPathogen-DungSaprotroph-Endophyte-Epi-phyte-PlantSaprotroph-WoodSaprotroph）、内生植物-凋落腐生物-土壤腐生物-未定义腐生物（Endo-phyte-LitterSaprotroph-SoilSaprotroph-UndefinedSaprotroph）等。结果表明，Se处理下降低了土壤植物病原体丰度，增加了一些腐生菌的数量，有利于加速土壤物质转化与循环，促进植物生长。
图7不同处理中草莓根际土壤真菌功能分析
3讨论与结论
已有研究证实，添加硒肥对土壤真菌群落多样性及结构具有显著影响[16]。本研究利用高通量测序技术，
对比分析了施加硒肥与不施硒肥2个处理之间根系土壤真菌群落的多样性及结构组成，共检测出11门35纲84目181科374属的1886个真菌ASVs。本研究发现，与对照相比，施加硒肥对根系土壤真菌群落的α多样性影响并不显著，这与Kang等[17]的研究结果一致，他们也发现Se处理降低了土壤微生物群落的丰度，对土壤微生物群落的Chao1和Shannon指数没有较大影响。
这可能是由于硒肥使用浓度较低的缘故[11]。LEfSe[18]分析发现，与Se0处理相比，Se处理下土壤嗜热菌属的相对丰度较高，可能是由于施加硒肥增加了草莓植株抗高温的能力。本研究进一步通过FUNGuild功能预测，发现施加硒肥后对土壤原虫、病毒等有一定的抑制作用，这与张之玄等[19]的试验结果相似。Kang等[17]也发现，施硒处理可以直接或间接抑制土壤病原微生物的生长。综上，本研究初步发现施加硒肥短期内对土壤真菌群落组成和功能产生了显著影响。然而硒肥的长期效果仍需要进一步验证，以明确硒肥处理下与土壤微生物群落组成及多样性的影响，为富硒草莓高效生产提供理论基础。
