矮牵牛Ph Ts2基因克隆与功能分析：花发育关键基因及雄性不育育种新资源
摘要
从矮牵牛‘幻想’中克隆了花发育相关基因PhTs2，该基因CDS长855 bp，编码284个氨基酸，具有保守的adh-short结构域。进化分析表明，PhTs2蛋白与同科植物烟草和番茄的同源蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现该基因在矮牵牛花药发育的早期特异性表达。为分析其功能，构建PhTs2超量表达载体，转化了烟草，并对转基因烟草进行了鉴定：表型观测发现其花药形态异常，花粉数量减少；花粉活力和萌发率极显著降低；扫描电镜观测发现其花粉粒畸形，外壁纹饰不规则；半薄切片显示其绒毡层发育过程紊乱。该研究为培育雄性不育系提供了潜在的基因资源。
关键词
矮牵牛；PhTs2；基因克隆；花药发育；雄性不育；超量表达；烟草转化；绒毡层
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引言与背景
矮牵牛（Petunia hybrida）由于花朵显著，遗传背景清晰，生长周期较短等，成为了分子遗传研究的模式植物（Gerats & Vandenbussche，2005；张慧琳 等，2019；周琴 等，2019）。商业化的矮牵牛品种多是通过杂交优势育种培育而来，因此，研究雄蕊发育及创制雄性不育系对于矮牵牛的育种具有重要的意义（Segatto et al.，2014）。
课题组前期通过抑制差减杂交文库筛选到一个与矮牵牛花发育相关的基因，该基因与Delong等（1993）从玉米中克隆得到的TASSELSEED2（Ts2）基因有同源关系，故命名为PhTs2（Yue et al.，2013）。玉米Ts2是一种性别决定基因，编码1种短链醇脱氢酶（short-chain dehydrogenase），该基因在雄穗花序的雌蕊群原基次上皮细胞中的表达水平很高，特别是在雌蕊群开始退化前这一时期，而在其他花器官和花发育时期中的表达水平都很低。
玉米Ts2在雌蕊原基中的表达可以引起雌蕊败育从而产生单性雄花，这表明Ts2很可能是在其他一系列基因表达决定了花器官的类别和数量以后才发挥作用的（Delong et al.，1993）。研究者随后在鸭茅状摩擦禾中发现gsf1基因，其与Ts2高度同源，且突变体的表型与玉米相似，雌蕊退化，产生穗状单性雄花（Li et al.，1997）。后期研究表明，Ts2不仅在雌蕊形成过程中诱导细胞死亡，还很可能具有调节或改变雌蕊形成途径中其他相关基因的活性及功能（Malcomber & Kellogg，2006）。
叉枝蝇子草中的STA1基因和拟南芥中的ATA1是Ts2的同源基因，但它们与Ts2有着不同的表达模式和功能：Ts2在雄穗花序的雌蕊群发育时表达，而STA1和ATA1只在花药绒毡层中特异性表达，可能在绒毡层的发育过程中具有保守的功能，并不是在雌蕊原基中表达引起雌蕊败育从而产生单性雄花（Lebel-Hardenack et al.，1997）。盛云燕等（2014）发现甜瓜CmTS2可能参与花器官发育，尤其是雌花的发育。目前还没有关于矮牵牛中Ts2同源基因的报道。
1 材料与方法
1.1 试验材料及PhTs2的克隆与生物信息分析
基因克隆及总RNA提取所用材料为矮牵牛‘幻想’，种植于华中农业大学花卉基地。遗传转化所用的烟草（Nicotiana tabacum ‘Xanthi’）为本实验室保存的组培苗。植物超量表达载体pCAMBIA2300和根癌农杆菌菌株EHA105均由本实验室保存。引物序列由上海桑尼生物科技有限公司合成。
设计基因特异性引物PhTs2-F（5′-CGGGATCCACGCGGGACCAATTGTTG-3′）和PhTs2-R（5′-GCGTCGACTGCCCGCACAGCAATGAAC-3′），从矮牵牛‘幻想’中扩增PhTs2完整的cDNA序列，连接到pMD18-T载体上并进行测序。通过FGENESH软件预测PhTs2完整的编码序列（CDS）。使用在线工具ProtParam进行序列基本特征分析。Plant-mPLoc用来预测其亚细胞定位（Chou & Shen，2010）。利用Pfam网站分析其保守结构域。
1.2 PhTs2的表达模式分析
参照Yue等（2017）的方法，以花芽长度代表发育时期，取长度为0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.5 cm的花芽及对应的花药，另取当日开放的花朵的萼片、花瓣、花药、雌蕊，以及植株的幼根、幼茎、幼叶、盛开的花，提取各样品的总RNA，反转录合成第1链cDNA后，使用引物qPhTs2-F（5′-TGGTAGGGCAAAGAGGGAGTC-3′）和qPhTs2-R（5′-CCCGCACAGCAATGAACC-3′）进行实时荧光定量分析PhTs2的表达水平。
1.3 PhTs2超表载体的构建及烟草的转化
用碱裂解法提取超量表达载体pCAMBIA2300质粒及pMD18-T-PhTs2质粒，并用限制性内切酶（TaKaRa）BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切。T4 DNA连接酶（TaKaRa）连接，从而构建pCAMBIA2300-PhTs2超量表达载体。
将pCAMBIA2300-PhTs2重组质粒电转化农杆菌EHA105感受态细胞。使用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，经过共生培养，筛选培养后将抗性芽转入生根培养基中诱导生根，然后将获得的生根苗炼苗后进行移栽，成活的即为T0代转基因植株（Ma et al.，2011）。
1.4 转PhTs2烟草T0代的鉴定及花器官观测
利用CTAB法提取转基因烟草T0代DNA，用35S-F（5′-ACGCAATCCCACTATCCTTC-3′）和基因下游特异引物PhTs2-R进行PCR检测。PCR反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，60℃复性30 s，72℃延伸1 min，36个循环；72℃延伸10 min，20℃保温。用1%琼脂凝胶电泳检测扩增产物。
选取7株PCR检测为阳性并与野生型存在一定差异表型的PhTs2转基因T0代烟草进行半定量RT-PCR分析。取1~1.5 cm长幼嫩花芽中的花药提取RNA，反转录合成第一链cDNA，稀释10倍作模板，以野生型烟草cDNA为阴性对照，所用引物为qPhTs2-F和qPhTs2-R，以烟草β-actin基因作为内部参照（Tian et al.，2019），进行PCR扩增。PCR产物经2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。
基于PhTs2花药早期特异性表达的特性，主要对转基因植株的花器官进行观测。
1.5 转基因烟草T1代的花粉育性检测
分别对野生型和PhTs2转基因烟草T0代进行自交授粉，同时用野生型烟草的花粉对转基因植物进行授粉，并对果实的发育情况进行观察。PhTs2转基因烟草T0代自交留种所育成的实生苗为T1代。提取T1代植株的DNA进行PCR检测，以鉴定阳性株系。同时种植了8株野生型作为对照。
于盛花期采集野生型及转基因T1代阳性植株即将开放的花朵，选择最长花丝上的花药进行醋酸洋红染色及花粉离体萌发试验，统计染色率（染成深红色的花粉粒数与花粉粒总数的百分比）和萌发率（萌发花粉粒数与花粉粒总数的百分比），计算花粉的生活力和萌发力（Huang et al.，2015）。每个株系进行3次重复。
1.6 转基因烟草T1代花粉形态的扫描电镜观测和花药发育半薄切片观测
分别将野生型和转基因T1代烟草的3个即将开放的花蕾（花芽发育到接近开花的状态）剖开，选取最长花丝上着生的花药保存于1%的戊二醛溶液中，进行缓冲液清洗、脱水、置换、临界点干燥、喷镀白金膜等过程，最后在扫描电子显微镜下观察花药形态（Bray et al.，1993）。
参考Porceddu等（1999）的方法，以花芽长度作为花药发育时期界定的指标。分别取野生型及转基因T1代烟草中长度分别为0.3、0.5、0.8、1.5、2.5和3.5 cm的花芽中的花药，使用Technovit 7100 Liquit对材料进行包埋，进行半薄切片观察（Yue et al.，2016）。