非洲紫罗兰LjCYC1基因遗传转化体系构建与叶盘法操作规程
摘要：本文详细介绍了利用农杆菌介导的叶盘法将百脉根LjCYC1基因转入非洲紫罗兰的实验流程。研究内容涵盖了受体材料对潮霉素（Hyg）敏感性的检测、转化载体pCAMBIA1301-LjCYC1的侵染与筛选、以及再生植株的GFP荧光检测、PCR鉴定与半定量RT-PCR分析。通过分子水平的验证，确证了外源基因在非洲紫罗兰根、叶、花瓣、雄蕊等多个器官中的表达，为后续观察基因对花对称性及器官属性的调控奠定了实验基础。
关键词：非洲紫罗兰；LjCYC1基因；叶盘法；农杆菌转化；潮霉素筛选；RT-PCR检测
一、筛选压确立：潮霉素（Hyg）敏感性检测
以非洲紫罗兰（Saintpaulia ionantha）试管苗的幼叶为转基因受体材料。取无菌幼嫩叶片，划伤后分别接种到含 0、10、15、20、25、30 和 40 mg · L-1潮霉素（Hygromycin，Hyg）的诱芽培养基中，培养 30 d 后观察生长状况，统计外植体的死亡率，选择可以抑制受体材料生长的最低浓度 Hyg作为筛选压。每个处理 30 块叶片，重复 3 次。
二、转化规程：叶盘法侵染与抗性芽分化
含百脉根 Lj CYC1 质粒 p CAMBIA1301-Lj CYC1 的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 由中国科学院上海植物生理生态研究所惠赠。在无菌条件下切取非洲紫罗兰幼叶（长约 1 cm），划伤表面，接种到愈伤组织诱导培养基（MS + 1.0 mg · L-1 BA + 0.1 mg · L-1 NAA + 30 g · L-1蔗糖 + 5 g · L-1琼脂粉）；预培养 2 d 后用农杆菌（含 Hyg 抗性基因、GFP 基因）侵染液（含 Km 和Rif）侵染 15 ~ 20 min，然后用无菌滤纸吸干菌液，转接到共培养培养基（愈伤组织诱导培养基 + 100 μmol · L-1 AS），黑暗条件下共培养 3 d。
用含 500 mg · L-1头孢霉素（Cef）的无菌水将叶片冲洗 3 ~ 5 次，放到无菌滤纸上晾干后接种到延迟培养基（MS + 1.0 mg · L-1 BA + 0.2 mg · L-1 NAA + 500 mg · L-1 Cef + 10 mg · L-1 Hyg + 30 g · L-1蔗糖 + 5 g · L-1琼脂粉）；延迟培养 7 ~ 10 d 后转入筛选培养基（MS + 1.0 mg · L-1 BA + 0.1 mg · L-1 NAA + 500 mg · L-1 Cef + 30 mg · L-1 Hyg + 30 g · L-1蔗糖 + 5 g · L-1琼脂粉）中，待转化受体形成愈伤组织或分化不定芽后转入分化培养基中继续抗性筛选，最后将分化的丛生苗转入生根培养基，待苗长出根系后移栽，置人工气候室培养。
三、分子验证：DNA/RNA提取与PCR检测技术
用 CTAB 法和 Trizol 法分别提取非洲紫罗兰转 Lj CYC1 植株叶片的 DNA 和 RNA，并以野生型植株为对照。RNA 经反转录后（按照 CWBIO 公司的 Hi Fi script c DNA Synthesis Kit 试剂盒使用说明书进行），用 Actin 引物对 c DNA 进行检验。
PCR 反应体系为 25 μL：16 μL dd H2O、2.5 μL 10× PCR Buffer、2.0 μL 2.5 mmol · L-1 d NTPs、1.0 μL Actin 正向引物（10 μmol · L-1）、1.0 μL Actin 反向引物（10 μmol · L-1）、2.0 μL c DNA 模板和 0.5 μL Taq DNA 聚合酶。PCR 产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳后分析比较。取转 Lj CYC1 再生非洲紫罗兰植株的根做成压片，在蔡氏荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况。以非洲紫罗兰转基因植株的基因组 DNA 为模板，用 Lj CYC1 特异性引物和 GFP 基因特异性引物分别进行 PCR 扩增。
四、组织特异性：不同器官的RT-PCR分析
为了解 Lj CYC1 在非洲紫罗兰各器官中的表达情况，提取转化植株的根，营养生长期的叶，开花期的叶、花序梗、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊的总 RNA，以 Actin 作为内参基因，对所有 c DNA 模板进行半定量 RT-PCR 分析。用 Lj CYC1 特异性引物对反转录产物进行 PCR 扩增，Actin 引物序列、PCR 反应体系及反应条件同 1.4。
经过分子检测的转基因和野生型非洲紫罗兰同时移栽到泥炭︰珍珠岩 = 7︰3 的基质中，在温度为（23 ± 2）℃，14 h 光照/10 h 黑暗条件下培养。对转基因植株的生长和花器官特征进行观察记录，并与野生型植株进行比较分析。