LjCYC1转基因非洲紫罗兰植株获得及不同器官表达分析研究

摘要：本文详细报道了转LjCYC1基因非洲紫罗兰的鉴定与分析结果。通过确定潮霉素（Hyg）最佳筛选压为30 mg·L-1，成功获得了抗性再生植株。利用GFP显微荧光检测、PCR扩增以及RT-PCR组织表达分析，验证了外源基因在非洲紫罗兰基因组中的成功整合与全株高效表达。研究结果显示，LjCYC1在根、叶及各花器官中均有表达，且在营养生长期叶片中的表达水平最高，为进一步研究CYC类基因调控花型对称性的功能奠定了基础。

关键词：非洲紫罗兰；LjCYC1基因；遗传转化；潮霉素筛选；GFP荧光检测；RT-PCR分析

一、筛选压确定：潮霉素对叶片再生的抑制效应

潮霉素（Hygromycin B，Hyg）对离体培养非洲紫罗兰叶片的生长及芽再生有强烈的抑制作用，由表 1 可见，在 30 和 40 mg · L-1 Hyg 的筛选培养条件下叶片再生芽受到严重抑制，全部褐化死亡。鉴于经过一段延迟培养后已有分化迹象的叶片抗性增加，同时为降低假阳性植株的数量，本试验中以 30 mg · L-1的 Hyg 作为外植体起始筛选压。

二、植株获得：农杆菌介导的转化与抗性芽分化

经农杆菌侵染后的非洲紫罗兰叶片共培养后，在温度为（23 ± 2）℃、12 h/12 h 黑暗的培养条件下经过 1 周延迟筛选后，转入筛选培养基，30 d 后开始有抗性芽形成。将抗性芽转入分化培养基继续筛选，待小苗长至 2 cm 时切下转入生根培养基，长出根系后移栽到花盆（图 1）。

三、荧光检测：GFP报告基因在细胞核中的表达

取转 Lj CYC1 非洲紫罗兰再生植株的根制成压片，用蔡氏荧光显微镜观察，在蓝光激发下可清楚地观察到根的细胞核发出绿色荧光，而野生型的根没有这种现象（图 2），这表明 GFP 已经在转基因植株中高效表达。

四、分子鉴定：目的基因LjCYC1的PCR扩增

利用 Lj CYC1 和 GFP 基因引物对随机挑选的 8 株转化再生植株的叶片进行 PCR 扩增检测。Lj CYC1 扩增结果（图 3，A）显示，其中 7 株扩增出大约 652 bp 的条带。

GFP 扩增结果（图 3，B）显示，有 6 株扩增出大约 538 bp 的条带，而野生型对照均没有扩增出任何条带，这说明 Lj CYC1 已初步整合到非洲紫罗兰基因组内。有 1 株只检测出 Lj CYC1 而没有检测出 GFP，可能是因为非洲紫罗兰基因组具有 CYC 的同源基因而导致 Lj CYC1 基因假阳性扩增的结果。

五、表达模式：LjCYC1在不同器官中的时空分布

RT-PCR 检测结果（图 4）显示，外源 Lj CYC1 在转基因非洲紫罗兰根、叶、花序梗、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊都高效表达，各组织中的表达量大致相同；营养生长期的叶中表达量高于生殖生长时期各个组织中的。