河南石斛的无菌播种与离体快繁技术研究
摘要：为建立河南石斛的无菌播种离体快繁技术体系，加快河南石斛资源保护和产业化利用，以河南石斛种子为外植体，采用不同的培养基配方开展了种子无菌萌发、分化、继代增殖及生根培养研究。结果表明，河南石斛种子播种后能快速萌发并分化成苗，最佳培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+香蕉100g/L+AC1.0g/L，培养30d时萌发率达到90%；将分化芽苗转接到继代增殖培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+香蕉100g/L+AC1.0g/L上培养，以“芽繁芽”方式增殖，其增殖系数可达8.0；最佳生根培养基为1/2MS+NAA0.6mg/L+香蕉100g/L+AC1.0g/L上，培养50d后可形成具发达根系的健壮植株；以松树皮和珍珠岩为基质，移栽成活率在90%以上。建立的上述快繁技术体系可直接应用于河南石斛的规模化种苗生产。
河南石斛（DendrobiumhenanenseJ.L.LiuetL.X.Gao）为兰科石斛属多年生植物，是1990年在河南省灵宝县、西峡县等地发现的新种[1]，现主要分布于河南、广西和贵州等省区，为我国特有的植物资源。河南石斛自然生长在森林覆盖率高、生态环境较好的地区，一般附生于树上或半阴湿的悬崖峭壁上。河南石斛具有较高的医疗和保健价值[2-3]，有益胃生津、滋阴清热、止咳润肺等功效。河南石斛在民间常用于各种肠胃疾病和肿瘤类疑难杂症的直接治疗，相传有“起死回生”之效，其药用价值不亚于铁皮石斛和霍山石斛。广西桂林是河南石斛的主要集中分布地之一[4]，由于河南石斛植株和花朵形态与霍山石斛（习称为“米斛”）极度相似[5-6]，广西当地药农和兰花爱好者常将其称之为“平头斛”或“桂林米斛”。
河南石斛还是极受欢迎的观赏石斛之一，因株型紧凑精致、花型素净典雅、花朵带浓香味，具有极高的观赏价值，备受众多的爱好者推崇[3]。近年来，由于人为过度采挖对生境的破坏，河南石斛野生资源数量已极为稀少，很多原有记载的分布点都再难觅其踪迹，野生资源濒临灭绝，目前河南石斛已被《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）列入附录I而禁止交易，也被世界自然保护联盟（IUCN）红色名录列为易危物种（VU）亟待保护，在新调整的《国家重点保护野生植物名录》（2021年第15号）中定为国家二级重点保护野生植物。
目前，石斛属植物的人工繁殖常采用茎段组织培养和种子无菌播种2种途径[7]，前者属于无性繁殖，优点是繁殖的种苗能保持与母株材料性状一致，缺点是会浪费较多的母本材料，继代增殖中材料容易发生变异退化，总体繁殖速度偏慢、产苗量小；后者属于有性繁殖，繁殖速度快、产苗量大，是目前规模化人工繁殖采用的主要途径。河南石斛人工授粉结实率高，能够获得饱满蒴果，且每个蒴果通常可含数万粒种子，因此采用种子大规模繁殖种苗具有十分诱人的前景。目前对河南石斛的研究较少，繁育方面仅见杨玉珍等[8]以茎段为外植体完成了其组培快繁，而利用种子进行无菌播种快繁的研究尚未见报道。因此，本研究以河南石斛人工授粉结实的蒴果为外植体，诱导种子无菌萌发、分化，并进行壮苗生根培养，比较不同培养基配方对快繁各阶段的影响，以建立河南石斛的无菌播种离体快繁技术体系，为下一步河南石斛资源保护和产业化利用提供支撑[4]。
1材料与方法
1.1材料
河南石斛[5]植物资源原生于广西桂林恭城县的西岭山，引种保存于“广西兰花良种培育中心”兰科植物种质圃内，于花期选择优良株系进行人工授粉并挂牌标记，采集成熟蒴果。
1.2方法
1.2.1消毒方法。采用兰科植物蒴果常规消毒法，将采收的蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉外表的灰尘和杂物，然后用体积分数75%的酒精浸泡60s，无菌水漂洗1次，再用0.1%HgCl2溶液消毒10min，无菌水漂洗5次，用无菌滤纸吸干蒴果表面水分备用。
1.2.2培养基的配置及培养条件。以MS[6]、1/2MS（大量元素和微量元素类物质用量为MS的1/2，其余成分不变）为基本培养基，附加20~30g/L蔗糖、3.5g/L的琼脂粉，pH值为5.8。培养基中植物生长调节剂选用6-苄基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA），添加物为香蕉、马铃薯和活性炭（AC），其中香蕉和马铃薯均采用去皮后加去离子水榨碎成汁液添加到培养基内。培养基配置后于121℃、压力105kPa条件下灭菌25min，冷却凝固后备用。培养环境条件为温度25±2℃，相对湿度60%~75%，光照强度25~40μmol/m2·s，光照时间14h/d。
1.2.3种子播种萌发及原球茎分化。将经表面消毒的蒴果用无菌刀片横向切开，将里面的种子均匀地撒播在以MS为基本培养基，添加植物生长调节剂（NAA0~0.8mg/L、6-BA0~2.0mg/L）和添加物（香蕉、马铃薯、活性炭）于培养基进行培养，观测种子萌发及生长情况，筛选最佳培养基配方。
1.2.4继代增殖。选取具1~2片叶、高1.0cm以上的小芽苗，接种到不同的继代增殖培养基上培养，培养基以MS为基本培养基，添加不同植物生长调节剂组合（6-BA0.2~2.5mg/L、NAA0.1mg/L）及添加物（香蕉、活性炭），培养50d后观测芽苗的增殖速度，筛选最佳继代增殖培养基配方。
1.2.5生根培养。选取株高2.5cm以上、具2~3片叶的植株转接到生根培养基上培养，培养基以1/2MS为基本培养基，添加100g/L香蕉、1.0g/L活性炭（AC）及不同浓度的NAA（0~1.0mg/L），培养50d后统计生根率和平均根数等指标，综合苗的健壮程度，筛选最佳壮苗与生根培养基配方。
1.2.6炼苗移栽。将瓶苗从培养室转移到温室大棚内，在大棚环境下炼苗15~20d，然后打开瓶盖取出试管苗，清水冲洗掉根部附着的培养基，阴凉通风处放置6~12h，晾干表面水分直至根系发白后，以2~4个单株集成一丛进行栽种，移栽60d后统计成活率。
1.2.7数据处理。采用SPSS21.0对记录的试验数据进行整理和方差分析。
2结果与分析
2.1不同培养基配方对种子萌发及生长的影响
河南石斛无菌播种能一步诱导种子萌发、原球茎增殖与分化。由表1可知，培养30d时在各培养基上均能萌发（图1A），其中7、9、10号培养基上萌发率最高，达到90%。观察不同培养基上原球茎的生长发现，培养基1~8上原球茎颗粒小、增殖少、生长慢，随着培养时间的增长，逐渐出现黄化死亡情况（图1B）；培养基9、10上，原球茎增殖和分化生长更快，芽苗生长健壮（图1C-F），可见添加马铃薯、香蕉和活性炭等添加物对河南石斛种子萌发后的生长具有显著促进作用，其中培养基9相较于10的芽苗颜色更加深绿且健壮。因此，河南石斛种子萌发和原球茎增殖及分化生长最佳的培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+香蕉100g/L+AC1.0g/L。
2.2不同培养基配方对继代增殖的影响
河南石斛种子萌发分化获得的芽苗比较细弱，采用“芽繁芽”的方式进行继代增殖培养，能扩大芽苗数量，促进快繁，同时还能增加植株粗壮度，提高瓶苗质量。由表2可知，各培养基的增殖系数均超过5.0，株高为2~5cm（图1G）。
综合比较，培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+香蕉100g/L+AC1.0g/L的继代增殖效果最佳，培养50d时的增殖系数达到8.0，植株生长健壮。
综合比较，培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+香蕉100g/L+AC1.0g/L的继代增殖效果最佳，培养50d时的增殖系数达到8.0，植株生长健壮。
2.3不同培养基配方对生根的影响
由表3可知，植物生长调节剂NAA对促进生根作用明显，当NAA使用浓度为0.4~1.0mg/L时，培养50d生根率能达到100%，其中以NAA浓度为0.6mg/L的平均根数最多，平均株高最高，植株生长良好（图1H，I）。因此，河南石斛最佳生根培养基为1/2MS+NAA0.6mg/L+香蕉100g/L+蔗糖20g/L+AC1.0g/L。
2.4炼苗移栽
试管苗移栽前通常需要适当炼苗驯化，以增强对外界环境条件的适应性。本试验中，先将瓶苗从培养室转移到温室大棚中自然放置15~20d，然后打开瓶盖取出植株，洗净根部附着的培养基，用甲基托布津1000倍液浸泡3min，取出在阴凉处放置约12h，待根系发白后进行移栽。移栽基质选用松树皮（颗粒大小3~6mm）和珍珠岩，先分别用清水充分浸泡后，按体积比为2∶1混合均匀，栽种容器为2.5寸塑料育苗杯。移栽后注意控制湿度、温度以及通风条件。采用该炼苗移栽方法，60d时观测到能抽生出新的叶片和根系，移栽成活率在90%以上。
3结论与讨论
外植体材料的选择是植物离体快繁的关键步骤，兰科石斛属植物离体快繁技术可采用的外植体材料有种子[9-11]、茎段[12]、叶片[13]和根[14]等，均能成功再生出植株。在对河南石斛人工繁殖中，杨玉珍等[8]以茎段为外植体通过诱导丛生芽并产生原球茎，再经过原球茎分化和壮苗生根完成了植株再生。本试验以人工授粉获得的种子为外植体，采用种子萌发、原球茎形成和分化一步培养，可以快速繁殖出数量巨大的无菌芽苗，经过生根培养后就能获得大量优质种苗，不需要耗费大量植株茎段材料，繁殖速度更快，在规模化生产中更具优势。
植物生长调节剂是兰科植物离体快繁取得成功的关键因素，通常对种子萌发、分化、继代增殖及生根等环节均有重要的影响[15-16]。本研究中，6-BA和NAA浓度对河南石斛种子的萌发影响较小，而对继代增殖及生根培养影响较大。当6-BA浓度高于2.0mg/L时，试管苗容易出现玻璃化现象，芽苗质量较差，当6-BA浓度低于0.5mg/L又不利于芽苗的长高。NAA则与生根培养密切相关，适宜的NAA浓度能显著地促进根系的生长和壮苗。
原球茎的形成及分化阶段通常是石斛属植物快速繁殖以及其能否规模化生产的关键阶段。河南石斛由于种子萌发获得的原球茎数量巨大，而且原球茎在分化成苗及壮苗培养等阶段都还有一定数量的增殖，因此可以不进行原球茎的增殖培养，而直接进行分化培养，这样在一定程度上避免了原球茎增殖过多导致的衰退、变异、分化及生根困难等问题。此外还发现，在“芽繁芽”的继代增殖培养过程中，有大部分植株已经生根，若后续研究通过调节培养基配方，使继代增殖和生根培养同步进行，将进一步缩短出苗周期，节省人力资源，对河南石斛种苗生产更有意义。
