基于Indel标记的新疆色素辣椒杂交种纯度鉴定
摘要：为充分利用Indel分子标记技术，建立新疆色素辣椒杂交种室内纯度快速鉴定体系，为后续的群体构建、QTL定位、杂交子代遗传多样性分析等相关研究提供依据，提高育种效率。利用251对Indel引物对10个品种的父母本共11个杂交组合的F1杂交代共96份材料的基因组DNA进行PCR扩增，寻找有扩增差异的引物，并对F1杂交代进行鉴定。结果表明，最终检测出33对特异性引物能扩增出清晰的差异条带，其中12对引物能够区别10个父母本材料及其F1代，最终在11个杂交组合86份子代中，检测出真杂交种67份，杂交成功率达77.9%。Indel分子标记技术在对新疆色素辣椒杂交种纯度鉴定中具有快速、准确等优点，在后续种质资源创新及育种工作中具有一定的应用价值。
辣椒（CapsicumannuumL.）是茄科（Solanaceae）辣椒属（Capsicum）重要的蔬菜经济作物，其中用于工业萃取辣椒红色素的，在案即色素辣椒。20世纪90年代初，新疆开始规模化种植色素辣椒，因其红色素含量和产量高且病虫害少而成为新疆“红色产业”重要组成之一[1-2]。色素辣椒新品种选育，包括杂交试配和品种比较等，其中杂交品种能整合亲本的优良基因，显著提高色素辣椒的产量、质量及抗性。随着育种进程的加快，辣椒产业发展速度迅猛[3]，品种也急剧增加，对于杂交种纯度的鉴定工作显得尤为重要。色素辣椒是常异花授粉植物，在人工杂交授粉过程中往往存在去雄不彻底不及时、虫媒风媒传粉等原因导致杂交子代不纯。传统的杂交种纯度鉴定一般采用田间种植后，调查杂交种的表型差异等计算纯度，易受环境和栽培方式的影响，且周期长、用地多、工作量大，在生产过程中会有性状不稳、选育失败的情况，无法满足快速准确检测杂交种纯度的需要[4]。因此，对杂交后代早期杂种纯度鉴定是遗传育种工作中的重大关键。
随着分子生物学辅助育种工作的开展，分子标记已大量用于杂交子代的纯度鉴定中。尤其是SSR分子标记已在辣椒[5]、番茄[6]、玉米[7]、油菜[8]等多种植物的杂交纯度鉴定上广泛应用。但是，Indel分子标记在辣椒杂交种纯度鉴定方面的报道非常少。InDel（inser-tion-deletionlengthpolymorphism，插入缺失长度多态性）是近缘种或同一物种不同个体之间基因组某一个位点插入或缺失部分碱基的情况[9]。据前人研究报道，Indel标记比SSR具有更多的优势，Indel标记在基因组中分布更广泛，其数量远多于SSR标记[10-11]，且鉴定结果更为可靠[12]。本试验选取11组色素辣椒杂交子代及其10份亲本材料，应用前期合成的251对Indel引物进行纯度鉴定，旨在初步建立适合色素辣椒杂交种纯度鉴定的Indel检测体系，逐步形成快速、准确的杂交种纯度室内鉴定技术，为色素辣椒育种、优良品种制种质量及大面积推广应用提供科学依据。
1材料与方法
1.1供试材料
参试的87份试材均由巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院特色作物研究室辣椒课题组提供，10份亲本材料（表1）于2021年1月在人工气候箱内播种育苗，每份材料育苗60株左右，于2月底移栽至温室内，配置杂交组合后于4月20日－5月15日进行常规人工杂交，最终获得共86份杂交子代单果为材料。亲本及杂交子代于2021年8月播于新疆农业科学研究院棉花楼组培室内，以备后续试验。
1.2试验方法
色素辣椒总DNA模板的提取、引物的合成、PCR反应体系及扩增程序（表2、3）、扩增产物检测（表4）同笔者前期发表的文章[13-14]基本一致。
2结果与分析
2.1DNA模板的检测
对10份亲本及86份杂交后代共96份材料提取DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测部分材料的纯度（图1），所提取DNA条带整齐清晰未见拖尾，样品间浓度较为均匀，利用核酸测定仪检测浓度，结果显示，OD260/OD280的比值位于1.7~2.0，浓度在192~197ng/μL，可以稀释一定比例后用于后续Indel-PCR分析。
2.2亲本间引物筛选
将前期试验中合成的251对Indel引物在10份亲本间进行多态性分析，剔除亲本间不存在多态性（图2A为引物Indel11-73、CIDH858）及亲本间存在多态性但非互补型条带（图2B为引物CIDH8）等情况的引物，最终检测出多态性引物为33对，经过多次重复、筛选，最终确定12对（表5）在双亲中多态性高，条带稳定、清晰的引物（图2C为引物CIDH179）用于后续杂交子代的鉴定及验证。
2.3杂交后代的In-del鉴定结果分析
利用表2中的12对引物对11个杂交组合的后代及其亲本进行PCR扩增，后代扩增结果中具有父母本互补型条带的即为真杂种，只具有父本或母本特异条带的后代为假杂种或自交种。例如引物CIDH963在杂交组合14×3的杂交子代（图3A）中鉴定出5~7为真杂种，1为自交种，2~4为假杂种；引物CIDH200在杂交组合13×5的杂交子代（图3B）中鉴定出1~3、5~8为真杂种，4为自交种；引物CIDH351在杂交组合2×12的杂交子代（图3C）中鉴定出1、3、5、7、8为真杂种，2、4、6为假杂种；引物CIDH270在杂交组合11×6的杂交子代（图3D）中鉴定出2~6、8为真杂种，1和7为假杂种。分析假杂种的原因可能为其他材料串粉或假种子混入。该试验11个杂交组合86个子代单果中，具有父母本特异条带的个体有67个，杂交成功率达77.9%（表6）。
3讨论
杂交子代纯度高低是作物育种成败的关键，也是种质资源创新的基础。由于色素辣椒常异花授粉的特点及人工去雄不及时、授粉操作不规范等情况，导致杂交后代群体中极有可能混有母本自交后代、外来种子及未知来源花粉混入的后代等，所以对杂交群体种子尽早地鉴定，既可以提高育种效率、节约成本，又能为分子辅助育种中遗传图谱构建、重要农艺性状QTL定位等奠定基础。
在色素辣椒育种过程中，通常以表型鉴定来直观、简便地选择优良种质资源，但表型由基因型和环境共同决定，在不同环境下或者反季种植会造成表型特征发生变化，且需要经验丰富的工作人员对亲本特性及品种性状差异很熟悉，不仅鉴定周期长、用地多、成本高，而且易受季节限制，严重影响鉴定的质量和速度[15-16]。
随着分子标记技术的飞速发展，包括Indel分子标记技术在内的多种标记方式，直接在分子水平揭示出杂交子代和亲本的区别，在杂交群体种子的早期鉴定研究中表现出了非常广阔的前景和应用价值。本研究利用Indel分子标记技术，在新疆色素辣椒杂交子代早期进行纯度鉴定，极大地减少了后期选育的工作量及成本、提高了杂交育种的工作效率，也为色素辣椒杂交后代的鉴定提供科学依据。对于试验中除亲本带型外新增条带的杂交子代，可结合形态学观测分析判断。对于已经鉴定为真杂种的子代，可为之后的分子标记辅助育种中构建群体、QTL定位等相关研究提供理论基础。
